一、 实验目的
1.掌握荧光光度计的基本原理及使用。
2.了解荧光分光光度计的构造和各组成部分的作用。
3.掌握分子荧光光度计分析物质的特征荧光光谱：激发光谱、发射光谱的测定方法。
4.了解影响荧光产生的几个主要因素。
5.学会运用分子荧光光谱法对物质进行定性和定量分析。
二、 实验原理
原子外层电子吸收光子后，由基态跃迁到激发态，再回到较低能级或者基态时，发射出一定波长的辐射，称为原子荧光。对于分子的能级激发态称为分子荧光，平时所说的荧光指分子荧光。
具有不饱和基团的基态分子经光照射后，价电子跃迁产生荧光，是当电子从第一激发单重态S1的最低振动能级回到基态S0各振动能级所产生的光辐射。
(1)激发光谱
是指发光的某一谱线或谱带的强度随激发光波长(或频率)变化的曲线。横坐标为激发光波长，纵坐标为发光相对强度。
激发光谱反映不同波长的光激发材料产生发光的效果。即表示发光的某一谱线或谱带可以被什么波长的光激发、激发的本领是高还是低；也表示用不同波长的光激发材料时，使材料发出某一波长光的效率。荧光为光致发光，合适的激发光波长需根据激发光谱确定——激发光谱是在固定荧光波长下，测量荧光体的荧光强度随激发波长变化的光谱。获得方法：先把第二单色器的波长固定，使测定的λem不变，改变第一单色器波长，让不同波长的光照在荧光物质上，测定它的荧光强度，以I为纵坐标，λex为横坐标所得图谱即荧光物质的激发光谱，从曲线上找出λex，，实际上选波长较长的高波长峰。
(2)发射光谱
是指发光的能量按波长或频率的分布。通常实验测量的是发光的相对能量。发射光谱中，横坐标为波长（或频率），纵坐标为发光相对强度。
发射光谱常分为带谱和线谱，有时也会出现既有带谱、又有线谱的情况。 发射光谱的获得方法：先把第一单色器的波长固定，使激发的λex不变，改变第二单色器波长，让不同波长的光扫描，测定它的发光强度，以I为纵坐标，λem为横坐标得图谱即荧光物质的发射光谱;从曲线上找出最大的λem。
(3)荧光强度与荧光物质浓度的关系
用强度为I0的入射光，照射到液池内的荧光物质时，产生荧光，荧光强度If用仪器测得，在荧光浓度很稀(A<0.05)时，荧光物质发射的荧光强度If与浓度有下面的关系：If=KC。
三、 实验试剂和仪器
试剂：罗丹明B乙醇溶液；1-萘酚乙醇溶液；3,3’-Diethyloxadicarbocyanine iodide：标准溶液，10μg/ml, 20μg/ml,30μg/ml,40μg/ml和未知浓度；蒸馏水；乙
醇。
仪器：Fluoromax-4荧光分光光度计；1cm比色皿；spectrofluorometer分析软件。
荧光分析仪器结构：它主要由光源、单色器、液槽、检测器和显示器组成。光源发出的紫外-可见或者红外光经过激发单色器分光后，照到荧光池中的被检测样品上，样品收到该激发光照射后，发出的荧光经发射单色器分光，由光电倍增管转换成相应电信号，再经放大器放大反馈进入转换单元，将模拟电信号转换成相应数字信号，并通过显示器或打印机显示和记录被测样品谱图。
四、 实验步骤
1.样品制备。配置不同浓度的3,3’-Diethyloxadicarbocyanine iodide溶液，分别为10μg/ml, 20μg/ml,30μg/ml,40μg/ml和未知浓度。
2.打开荧光分光光度计和电脑，预热半个小时。
3.打开spectrofluorometer分析软件，进行相关参数的设置。首先检测罗丹明B的激发光谱，此时固定发射波长为560nm，检测并保存激发光谱。然后根据所检测的激发光谱中的最大峰值541nm来设置检测罗丹明B的荧光光谱的激发波长，检测并保存所得的荧光光谱。
4.检测1-萘酚的荧光光谱。方法同步骤3。
5.用已配置好的3,3’-Diethyloxadicarbocyanine iodide标准溶液进行与2中相同的步骤，找到最大激发波长与最大发射波长，之后选定单点检测模式，并设置成刚选择的最大激发波长与最大发射波长，分别对10μg/ml, 20μg/ml,30μg/ml,40μg/ml进行检测，记录数据，绘制工作曲线。
6.对未知浓度3,3’-Diethyloxadicarbocyanine iodide进行检测，记录数据，并根据工作曲线求出浓度。
五、 数据记录和处理
1. 数据记录
(1)罗丹明B的测定
图2.罗丹明B的激发光谱
图3.罗丹明B的荧光光谱